DB21∕T 3692-2023 蓝莓常见品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
《DB21∕T 3692-2023 蓝莓常见品种鉴定技术规程 SSR分子标记法》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB21∕T 3692-2023 蓝莓常见品种鉴定技术规程 SSR分子标记法(15页珍藏版)》请在读根文库上搜索。
1、I C S 6 5.0 2 0.0 1C C S B 6 021辽 宁 省 地 方 标 准D B 2 1/T 3 6 9 2 2 0 2 3蓝 莓 常 见 品 种 鉴 定 技 术 规 程S S R 分 子 标 记 法T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n f o r i d e n t i f i c a t i o n o f c o m m o n b l u e b e r r y v a r i e t i e sb y S S R m o l e c u l a r m a r k e r s2 0 2 3-0 1-3 0 发 布 2
2、0 2 3-0 3-0 2 实 施辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 2 1/T 3 6 9 2 2 0 2 3I目 次前 言.I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 试 验 准 备.25 操 作 程 序.26 结 果 分 析.4附 录 A(规 范 性)仪 器 设 备 与 化 学 试 剂.5附 录 B(规 范 性)溶 液 配 制.6附 录 C(规 范 性)核 心 引 物 信 息.8附 录 D(资 料 性)扩 增 图 谱.9附 录 E(资 料 性)指 纹 图 谱.1 0附 录 F(规 范 性)指 纹 图 谱 鉴 定 报 告.1 1图
3、D.1 引 物 S S R 1 0 0 7、S S R 1 1 8 3、S S R 1 6 0 在 1 2 个 蓝 莓 主 栽 品 种 中 的 扩 增 图 谱.9表 C.1 4 对 S S R 核 心 引 物 信 息.8表 E.1 1 2 个 蓝 莓 主 栽 品 种 的 S S R 数 字 指 纹 图 谱.1 0表 F.1 蓝 莓 品 种 S S R 指 纹 图 谱 鉴 定 报 告.1 1D B 2 1/T 3 6 9 2 2 0 2 3I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分:标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规
4、 则 的 规 定起 草。本 文 件 由 辽 宁 省 林 业 和 草 原 局 提 出 并 归 口。本 文 件 起 草 单 位:大 连 大 学、大 连 森 茂 现 代 农 业 有 限 公 司。本 文 件 主 要 起 草 人:徐 国 辉,王 贺 新,楚 立 威,娄 鑫,赵 倩,温 立 柱,崔 青 青,周 永 斌。本 文 件 发 布 实 施 后,任 何 单 位 和 个 人 如 有 问 题 和 意 见 建 议,均 可 以 通 过 来 电 和 来 函 等 方 式 进 行 反 馈,我 们 将 及 时 答 复 并 认 真 处 理,根 据 实 际 情 况 依 法 进 行 评 估 及 复 审。归 口 管 理 部
5、门 通 讯 地 址:辽 宁 省 林 业 和 草 原 局(沈 阳 市 和 平 区 太 原 北 街 2 号),联 系 电 话:0 2 4-2 3 4 4 8 9 2 7。文 件 起 草 单 位 通 讯 地 址:大 连 大 学(大 连 市 经 济 技 术 开 发 区 学 府 大 街 1 0 号),联 系 电 话:0 4 1 1-8 7 4 0 2 3 4 6。D B 2 1/T 3 6 9 2 2 0 2 31蓝 莓 常 见 品 种 鉴 定 技 术 规 程S S R 分 子 标 记 法1 范 围本 文 件 规 定 了 利 用 简 单 重 复 序 列(S i m p l e s e q u e n c
6、 e r e p e a t s,S S R)分 子 标 记 法 对 1 2 个 常 见 蓝 莓 品 种,进 行 鉴 定 过 程 中 样 品 准 备、D N A 提 取、D N A 质 量 检 测、P C R 扩 增、P C R 产 物 检 测 等 方 面 的 技 术 要 求。本 文 件 适 用 于 S S R 分 子 标 记 技 术 构 建 1 2 个 常 见 蓝 莓 品 种 D N A 指 纹 图 谱 过 程 中 D N A 分 子 数 据 采 集 和鉴 别。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不
7、 可 少 的 条 款。其 中,注 日 期 的 引 用 文 件,仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件;不 注 日 期 的 引 用 文 件,其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本文 件。G B/T 6 6 8 2 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法L Y/T 2 4 2 6 枣 品 种 鉴 定 技 术 规 程 S S R 分 子 标 记 法3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1聚 合 酶 链 式 反 应 P C R p o l y m e r a s e c h a i n r e a
8、c t i o n聚 合 酶 链 反 应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R),是 以 D N A 为 模 板,在 D N A 聚 合 酶、引 物、d N T P的 共 同 作 用 下 使 目 标 片 段 扩 增 并 用 于 检 测 分 析。3.2S S R 标 记 s i m p l e s e q u e n c e r p e a t s m a r k e r由 几 个 核 苷 酸(一 般 为 1 6 个)为 重 复 单 位 组 成 的 长 达 几 十 个 核 苷 酸 的 串 联 重 复 序 列。3.3核 心 引 物
9、c o r e p r i m e r s扩 增 产 物 具 有 高 度 的 稳 定 性 和 一 致 性,并 具 有 较 强 的 鉴 别 能 力,可 以 用 于 进 行 1 2 个 蓝 莓 常 见 品 种 比对 的 人 工 合 成 引 物。3.4S S R 指 纹 图 谱 S S R f i n g e r p r i n tD B 2 1/T 3 6 9 2 2 0 2 32利 用 S S R 核 心 引 物,对 不 同 的 蓝 莓 品 种 进 行 P C R 扩 增,根 据 不 同 品 种 在 D N A 水 平 上 的 差 异,利 用 聚丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 技 术,获 得 的
10、 具 有 差 异 片 段 的 成 像 图,并 通 过 引 物 结 合 字 母 标 记 法 对 不 同 的 蓝 莓 品 种进 行 特 异 性 标 记。4 试 验 准 备4.1 仪 器 与 试 剂仪 器 与 试 剂 详 见 附 录 A。4.2 溶 液 配 制溶 液 配 制 方 法 详 见 附 录 B,其 中 试 剂 配 制 所 用 水 应 符 合 G B/T 6 6 8 2 规 定 的 一 级 水 的 要 求,其 中 银 染、显 色 溶 液 的 配 制 可 以 使 用 符 合 三 级 水 的 要 求。4.3 核 心 引 物核 心 引 物 信 息 详 见 附 录 C。5 操 作 程 序5.1 样 品
11、 准 备选 取 蓝 莓 新 鲜 叶 片,-2 0 运 输,-8 0 进 行 长 期 保 存。5.2 D N A 提 取对 于 采 集 的 新 鲜 嫩 叶,使 用 试 剂 盒(T I A N G E N)进 行 D N A 提 取。操 作 步 骤 如 下:a)处 理 材 料:取 植 物 新 鲜 叶 片 2 0 m g,加 入 液 氮 充 分 碾 磨 后 转 移 至 1.5 m L 离 心 管 中,加 入 4 0 0 L缓 冲 液(L P 2)和 6 L R N a s e A(1 0 m g/m L),漩 涡 震 荡 1 m i n,室 温 放 置 1 0 m i n;b)加 入 1 3 0 L
12、 缓 冲 液(L P 2),充 分 混 匀,漩 涡 震 荡 1 m i n;c)1 2,0 0 0 r p m(1 3,4 0 0 g)离 心 5 m i n,将 上 清 液 移 至 新 的 离 心 管 中;d)加 入 1.5 倍 体 积 的 缓 冲 液(L P 3)(例 如 5 0 0 L 的 上 清 液 加 7 5 0 L 缓 冲 液(L P 3),立 即 充分 振 荡 混 匀 1 5 s。此 时 会 出 现 絮 状 沉 淀;e)将 上 一 步 所 得 溶 液 和 絮 状 沉 淀 都 加 入 一 个 吸 附 柱(C B 3)中(吸 附 柱 放 入 收 集 管 中),1 2,0 0 0r p
13、 m(1 3,4 0 0 g)离 心 3 0 s,倒 掉 废 液,吸 附 柱(C B 3)放 入 收 集 管 中;f)向 吸 附 柱(C B 3)中 加 入 6 0 0 L 漂 洗 液(P W)(使 用 前 请 先 检 查 是 否 已 加 入 无 水 乙 醇),1 2,0 0 0r p m(1 3,4 0 0 g)离 心 3 0 s,倒 掉 废 液,吸 附 柱(C B 3)放 入 收 集 管 中;g)重 复 操 作 步 骤 f;h)将 吸 附 柱(C B 3)放 回 收 集 管 中,1 2,0 0 0 r p m(1 3,4 0 0 g)离 心 2 m i n,倒 掉 废 液。将 吸 附 柱(
14、C B 3)置 于 室 温 放 置 数 分 钟,以 彻 底 晾 干 吸 附 材 料 中 残 余 的 漂 洗 液;i)将 吸 附 柱(C B 3)转 入 一 个 干 净 的 离 心 管 中,向 吸 附 膜 的 中 间 部 位 悬 空 滴 加 5 0 L-2 0 0 L 洗 脱 缓冲 液(T E),室 温 放 置 2 m i n-5 m i n,1 2,0 0 0 r p m(1 3,4 0 0 g)离 心 2 m i n,将 溶 液 收 集 到 离 心管 中,以 待 检 测。5.3 D N A 质 量 检 测5.3.1 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 D N AD B 2 1/T 3 6 9
15、 2 2 0 2 33取 1 L 提 取 的 D N A 原 液,在 1 0 0 V 的 电 压 下,用 0.8%的 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 2 0 m i n 左 右,取 出 凝 胶,在 紫 外 凝 胶 成 像 系 统 上 观 察 电 泳 条 带 应 单 一、无 拖 尾。5.3.2 鉴 定 D N A 的 浓 度 和 质 量吸 取 1.5 L 提 取 的 D N A 原 液,通 过 N a n o D r o p 检 测 D N A 浓 度 和 是 否 有 R N A、蛋 白 质 或 酚 污 染,纯 净样 品 D N A O D 2 6 0/O D 2 8 0 的 比 值 应 在
16、 1.7-1.9 之 间。5.4 P C R 扩 增5.4.1 反 应 体 系S S R 的 反 应 体 系:正 反 向 引 物(1 0 m o l/L)各 1 L、2 T a q P C R M a s t e r M i x 8 L、模 板 1 0 0 n g、添 加 灭 菌 超 纯 水 至 2 0 L。所 使 用 的 S S R 引 物 根 据 已 公 布 的 蓝 莓 品 种 D r a p p e r 基 因 组 自 主 研 发 获 得。5.4.2 反 应 程 序9 4 预 变 性 1 0 m i n,9 4 变 性 4 0 s,退 火 7 0 s(具 体 退 火 温 度 根 据 引
17、物 来 定,详 见 附 录 C),7 2 延 伸 2 m i n,3 5 个 循 环,7 2 延 伸 1 0 m i n。5.5 P C R 产 物 检 测扩 增 产 物 用 1 2%聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 进 行 检 测,通 过 扫 描 仪 进 行 拍 照,用 人 工 读 带 和 字 母 数 字 结 合的 方 法 进 行 分 析。5.5.1 凝 胶 制 备将 洗 净 晾 干 的 玻 璃 板 用 水 平 灌 胶 的 方 式 组 装 玻 璃 板,铁 夹 固 定,取 8 m L 5 T B E,1 6 m L 3 0%丙烯 酰 胺,1 5 m L 去 离 子 水 于 烧 杯 中,加 入
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB21T 3692-2023 蓝莓常见品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 DB21 3692 2023 蓝莓 常见 品种 鉴定 技术规程 SSR 分子 标记
